一旦通过培养后分离出微生物，就应进行鉴定。 识别对于确定管理（例如，药物治疗、隔离措施）很重要。非核酸基础的鉴定方法利用微生物的表型（功能或形态）特征而非基因型（如核酸扩增技术）特征。
微生物在培养基上的生长特征（如菌落大小、颜色和形状）结合革兰染色及进一步检测，可为菌种鉴定提供线索。
有很多生化试验可以应用，但是每一项试验都受到微生物种类（如需氧或者厌氧细菌）的限制。部分试验通过评估微生物利用不同底物生长的能力来进行鉴定。其他试验则评估关键酶（如凝固酶、过氧化氢酶）的存在或活性。 检测按顺序进行，先前的结果决定下一次的检测方法。测试的顺序多种多样，各实验室之间有所不同。
以非核酸鉴定方法可能包括
手工方法
自动化系统
血清学检测
色谱法
质谱分析
某些商用试剂盒包含可同时进行的多项独立检测，仅需单次微生物接种即可完成，适用于更广谱的微生物检测。多重试验体系可以使结果更加精确，但是可能需要数天才能得到结果。
血清学检测
血清学检测（免疫学或生化）可用于检测体液免疫反应，特别是检测对感染性病原体释放的抗原或抗原本身（如梅毒或隐球菌相关抗原）产生的抗体。
色谱法
微生物的组成成分或者产物可以通过使用高效液相色谱仪（HPLC）或者气体色谱仪进行分离和鉴别。通常通过将微生物的脂肪酸与数据库进行比较来进行鉴定。
色谱法可用于鉴别需氧和厌氧菌、分枝杆菌以及真菌。试验的准确性依赖于对样本进行培养的条件以及数据库的质量，而数据库可能不准确或不完整。
质谱分析
质谱法可以检测一份标本中不同质量的各种蛋白质。特定病原体具有独特的蛋白质，每种蛋白质的相对质量和丰度有时可以用来鉴定微生物。质谱是正在或已经开发用于检测和识别生物战和生物恐怖主义剂的诸多创新技术之一。然而，这种方法有局限性，因为它不同于一些基于核酸的方法，不易在现场部署。
目前，一种称为基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）的质谱分析法正被用于鉴定细菌（包括分枝杆菌）、酵母、霉菌和潜在的病毒。 该方法的优点是，可以在1小时内鉴定微生物；传统方法可能需要24~48小时。
