组织的显微镜检查可能需要区分病原微生物来自于侵袭性疾病或仅仅为表面定植－这种区分往往难以由培养来判别。
尽管未染色的湿片样品可用于检测真菌和某些其他病原体，但大多数样品都用染色剂处理，使病原体颜色鲜艳，使它们从背景中显示出来。
临床医生根据可能的病原体进行染色。然而，没有一种染色剂是100%特异的（即不同的生物体可能有类似的染色）。大多数样本用革兰染剂染色，如果怀疑是分枝杆菌则要选用抗酸染剂。然而有一些病原体使用这些染剂则不能被轻易观察到；如果怀疑是此类病原体，需要使用不同的染剂或采用其他可以进行鉴定的方法。
因为显微镜下检测通常要求标本中微生物浓度至少达到1×104-5/mL，所以大多数体液标本（如CSF）在检查前都需要浓缩处理（如通过离心）。
光学显微镜可以快速完成，但准确性取决于显微镜医生的经验和设备的质量。除标准的实验室外，由于质控方面的不足常常限制了医生选择显微镜检查作为确诊的方法。
革兰氏染色法
革兰染色需进行以下操作
革兰染色是通过细菌能保留紫色晶体染剂（革兰阳性——蓝色）或不能保留（革兰阴性——红色）来将细菌分类。
同时能够显示出细胞的形态（如杆菌或球菌）和细胞的排列（如：丛状、链状、二倍体）。
鉴定多形核白细胞，表明细菌感染而非定植
可以根据这些特征最终确定抗生素治疗方案。 革兰染色后发现具有多种形态及染色特征的微生物混合物，提示样本受到污染或多种微生物细菌感染。在痰标本中发现许多鳞状细胞，表明标本被唾液污染，因此诊断作用有限。
革兰染色是将标本通过热固定于载玻片上，相继用革兰紫色晶体、碘、脱色剂和复染剂（具有代表性的是番红精）处理。
抗酸染色和改良抗酸染色
这些染色方法用于检测以下病原：
抗酸染色阳性的病原（Mycobacterium 属）
抗酸染色弱阳性的微生物（主要是Nocardia 类）
Rhodococcus 红球菌和相关的属
分枝杆菌在痰液中的含量达到10,000个/mL就能被检测出，但是因为它常常在标本中以更低的浓度水平存在，检测的灵敏度因此受限。 通常，数mL的痰液用氢氧化钠去污染后经过离心浓缩，才进行抗酸染色。尽管一些中等抗酸的微生物很难从分枝杆菌中区分出来，但是这种方法的特异度仍较可信。
荧光染色
荧光染色可用于检测更低浓度的标本（<1×104细胞数/mL）。例子
吖啶橙（细菌和真菌）
金胺-罗丹明和金胺O染色（分枝杆菌）
荧光增白剂（真菌，尤其是皮肤真菌）
病原菌抗体和荧光剂偶联（直接或间接免疫荧光）理论上可以提高检测的灵敏度和特异度。 然而由于这些试验结果的解读和解释有一定的困难，因此商业上仅极少数方法有利用价值而常规使用（如Pneumocystis and Legionella直接荧光抗体试验）。
湿片法
湿载的未染色样品可用于在暗场显微镜下检测以下物质：
为了提高真菌的可分辨度，可用10%氢氧化钾（KOH）溶解周围的组织和非真菌病原体。
墨汁染色法
印度墨汁（胶体碳）染色主要用于检测细胞悬浮液（如脑脊液沉淀物）中新型隐球菌和其他具有包囊的真菌。该方法主要是使背景视野被染色而不是微生物本身被染色，染色后使微生物的荚膜呈晕轮状而易被观察到。在CSF中其灵敏度不如隐球菌抗原检测。特异度也受到限制：白细胞也可能呈现包囊状。
Warthin-Starry染色法和Dieterle染色法
这些银染色是用来使细菌可视如
Helicobacter pylori幽门螺旋体
Bartonella henselae 巴尔通体（猫抓病的原因）
赖特染色和吉姆萨染色
这些染色方法用于检测以下微生物：
血液中的寄生虫
吞噬细胞和组织细胞中的荚膜组织胞浆菌
由病毒和衣原体形成的细胞内包涵体
耶氏肺孢子菌Pneumocystis jirovecii
一些胞内细菌
三色染色法（Gomori-Wheatley染色法）和铁苏木精染色法
这些染色方法用于检测肠道内的原虫。
果莫里-Wheatley染色用于检测微孢子虫。它可能遗漏蠕虫卵和幼虫，并且用于检测隐孢子虫也不可靠 Cryptosporidium。真菌和人的细胞会被染色。
铁苏木精染色可以鉴别染色的细胞、细胞包含物和细胞核。当用于对蠕虫卵进行染色时，应避免染得太深而难以检测。
