脑脊液流动于覆盖在脑和脊髓的组织的中间层和内层（脑膜）之间的通道（称为蛛网膜下腔）内。为了取出这种液体的样本，医生在下脊柱的两块骨头(椎骨)之间插入一根小的空心针，通常是第三块和第四块或第四块和第五块腰椎，在脊髓末端以下，然后插入蛛网膜下腔 ——覆盖脊髓(和脑部)的组织层(脑膜)之间的空间。腰穿时，患者取侧卧位，屈曲双膝至胸。这个体位可充分增宽椎间隙，以避免穿刺针插入时碰及椎骨。

然后将脑脊液滴入试管中，再将标本送到实验室化验。